第二节　放射性粒子和外照射对非小细胞肺癌细胞生物学效应的区别

肿瘤细胞最典型的特征是生长失控和凋亡受阻，如何更有效地抑制肿瘤细胞的生长、促进肿瘤细胞的凋亡是治疗肿瘤的关键。而电离辐射主要作用于肿瘤细胞DNA，诱发DNA双链断裂，最后诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长。其中决定肿瘤细胞辐射敏感性的是DNA双链断裂后肿瘤细胞修复双链断裂的能力。在放射治疗之后，DNA损伤修复和细胞周期关卡等一系列信号通路网络被激活以应对电离辐射对细胞的损伤，从而维持基因组的稳定性。一旦修复失败或不可逆的损伤积累到一定程度，细胞将启动凋亡程序从而诱导细胞发生凋亡。电离辐射诱导的细胞凋亡主要通过线粒体依赖的内源性凋亡途径发生，整个过程涉及一系列凋亡相关的基因，如促凋亡基因Bax、Caspase-3、PARP等及促生长基因Bcl-2等。在所有的凋亡相关基因中Bcl-2和Bax是一组最重要的调节凋亡的基因，两者在正常情况下的表达相对稳定。当Bcl-2蛋白表达升高时Caspase-3蛋白的激活将被抑制；相反，当Bax蛋白表达升高时将会促进Caspase-3蛋白的激活，继而诱导细胞凋亡发生。

单个细胞进行体外培养，当分裂增殖超过6代时就可以形成一个细胞数目在50个以上，大小为0.3～1mm细胞群体，即克隆，也称集落形成单位。各种理化处理因素都会引起细胞的集落形成能力产生变化，通常把克隆作为一个评估离体细胞分裂增殖特性的指标，通过检测克隆形成率，进一步分析各理化因素对细胞分裂增殖的影响。而肿瘤是由不同增殖及分化能力的瘤细胞群构成，其中仅有部分肿瘤细胞具有自我更新能力，即肿瘤干细胞。目前认为只有肿瘤干细胞具有形成克隆的能力。当肿瘤细胞在受到一定阈值的内外源性理化因素（如电离辐射、化学药物、日光照射等）刺激后发生DNA双链断裂，如DNA双链断裂修复失败，则意味着发生细胞死亡，细胞死亡的主要表现形式是细胞凋亡。肿瘤细胞一旦发生死亡则失去无限增值的能力，即不能形成克隆。

王忠敏等选取肺腺癌细胞株A549、H1299及正常支气管黏膜上皮细胞株BEAS-2B作为研究对象，采用不同剂量的125I放射性粒子对A549、H1299及BEAS-2B细胞行体外持续照射，通过研究两种电离辐射对A549、H1299、BEAS-2B细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡以及Bax、Bcl-2、Caspase-3、PARP等凋亡相关蛋白表达水平的影响，探讨125I粒子CLDR照射和60Co γ射线HDR照射对非小细胞肺癌（nonsmallcell lung cancer，NSCLC）细胞株生物学效应影响的差异以及抑癌效应背后的分子机制。结果显示照射组中A549及H1299细胞分别行125I粒子CLDR照射和60Co γ射线HDR照射后，克隆存活分数较对照组显著降低（P＜0.05）。其中A549及H1299细胞在照射剂量为4Gy、6Gy、8Gy时，125I粒子CLDR照射组中细胞克隆存活分数较60Co γ射线HDR照射组中克隆存活分数降低更显著（P＜0.05）。尽管在照射剂量为2Gy时125I粒子CLDR照射和60Co γ射线HDR照射后A549及H1299细胞克隆存活分数之间差异并不明显。研究提示人正常支气管黏膜上皮BEAS-2B细胞在同样照射条件下，125I粒子CLDR照射和60Co γ射线HDR照射所致克隆存活分数之间差异无统计学意义（P＞0.05）。该研究显示125I粒子CLDR照射和60Co γ射线HDR照射后，A549细胞的克隆存活分数均显著低于BEAS-2B细胞（P＜0.05）。

高保守的DNA损伤修复及细胞周期关卡效应使得细胞可以应对内、外源性的DNA损伤。DNA损伤以及损伤后修复的情况在一定程度上决定了细胞是否发生永生化，即癌变，同时也一定程度上决定了肿瘤对治疗的敏感性。其中细胞在电离辐射损伤后为保证遗传基因组的稳定性，首要反应就是诱导细胞发生周期阻滞，以便有充足的时间激活DNA损伤修复程序以修复损伤的DNA，一旦DNA损伤修复失败或修复不彻底，即启动死亡程序，从而导致细胞出现不同的命运。茅爱武等研究结果显示，125I放射性粒子CLDR照射较60Co γ射线HDR照射对NSCLC细胞A549及H1299细胞生长抑制作用更加显著。同时两株非小细胞肺癌细胞间也存在显著差异。与60Co γ线HDR照射相比，125I粒子CLDR照射导致A549细胞发生更明显的G1期阻滞，并与Wang等、Liao等以胰腺癌细胞、前列腺癌细胞作为实验模型的研究结果趋势一致。

有研究表明在初始剂量率为2.77cGy/h、照射剂量为4Gy时，A549细胞发生长时程的G2/M期阻滞。在茅爱武等研究中，125I粒子初始剂量率为7.44cGy/h，在照射剂量为4Gy时，A549细胞发生明显的G1期阻滞。初始剂量率的不同以及细胞状态等一系列因素的影响，可能是导致该差异的部分原因，但由于各种限制没有对该差异背后具体的机制进行深入的研究。同样的照射条件下，BEAS-2B细胞表现为G2/M阻滞，尽管两种电离辐射照射后细胞周期阻滞的程度并无明显差异。

细胞受到电离辐射损伤后主要经过线粒体依赖的内源性凋亡途径诱导DNA受到损伤的细胞发生凋亡，凋亡进程中涉及一系列凋亡相关蛋白包括Bax、Bcl-2、Caspase-3、PARP等蛋白。其中Bcl-2蛋白主要发挥抑制凋亡、延长细胞存活的作用，该蛋白也称“促生长蛋白”，在NSCLC细胞中过表达Bcl-2蛋白通常意味着肿瘤细胞对治疗不敏感或者不理想。Bax蛋白是Bcl-2蛋白家族中与Bcl-2蛋白作用相反的另一个成员，主要发挥促进凋亡的作用，因此也称“促凋亡蛋白”。通常Bcl-2蛋白和Bax蛋白之间的比率决定了细胞是否发生凋亡。茅爱武等研究表明：①在照射剂量为4Gy、8Gy时与60Co γ射线HDR照射相比，125I粒子CLDR照射明显上调A549、H1299细胞促凋亡蛋白Bax的表达，同时下调促生长蛋白Bcl-2表达，这表明Bcl-2蛋白和Bax蛋白比率的失衡有可能加速A549及H1299细胞凋亡事件的发生，但并不排除其他可能的机制，这也将会在后续研究中进一步探讨。②在凋亡进程中Caspase-3蛋白是最重要的凋亡执行分子，通常Caspase-3蛋白的活化，并进一步激活底物PARP蛋白，即Cleavedcaspase-3及Cleaved-PARP蛋白的出现标志着凋亡事件的发生，A549、H1299细胞中Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP蛋白表达水平显著升高。通常认为肿瘤细胞在电离辐射后出现G2/M期阻滞或G1阻滞，继而启动DNA损伤修复程序，如修复失败，则启动凋亡程序使DNA受到严重损伤并且修复失败的细胞发生凋亡从而避免了细胞发生突变进而发生癌变，在茅爱武团队研究中表现为A549细胞产生显著的G1期阻滞、H1299细胞产生显著的G2/M期阻滞，继而导致Bcl-2/Bax蛋白表达的失衡，并诱导Caspase-3及PARP蛋白的活化，最终导致凋亡事件的发生。