第二章　新生儿基因筛查方法

第一节　基因筛查进展

新生儿疾病筛查是指在新生儿群体中，用快速、简便、敏感的检验方法，对一些危害儿童生命、导致儿童体格及智能发育障碍的遗传性疾病进行筛检，做出早期诊断，可在患儿临床症状出现之前给予及时治疗，避免患儿机体各器官受到不可逆损害的一项系统保健服务。

1961年，美国Guthrie教授应用细菌抑制法，检测干滤纸血片中苯丙氨酸的浓度筛查苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）。1973 年，Dussault 教授等用干血滤纸片采集新生儿末梢血，并通过放射免疫法测定T₄筛查先天性甲状腺功能减退症（congenital hypothyroidism，CH）；1975年，日本 Irie和Naruse教授通过干血滤纸片中测定TSH成功筛查CH。从此之后，以PKU与CH为主要疾病的新生儿早期筛查开创了新生儿疾病筛查的历史，其良好的社会效益和经济效益为以后进行更多新生儿疾病筛查提供了范例。1990年，美国杜克大学陈垣崇教授研究团队首先提出了利用串联质谱技术（tandem mass spectrometry，MS/MS）进行新生儿疾病筛查，此技术能在2～3分钟内对干滤纸血片标本单次检测同时分析数十种小分子代谢物，可以筛查出包括氨基酸、有机酸和脂肪酸氧化代谢紊乱在内的50多种遗传代谢病（inherited metabolic disease，IMD），还可用于溶酶体贮积症的筛查，实现了由传统新生儿IMD筛查的“1种实验-1个代谢物-1种疾病”向“1种实验-多个代谢物-多种疾病”的转变。由于MS/MS检测快速、灵敏、高通量和选择性强等特点，在新生儿IMD筛查应用中扩展了筛查疾病谱，提高了筛查效率及筛查特异度、灵敏度，无疑是自细菌抑制实验筛查苯丙酮尿症的40多年来在IMD筛查方面取得的最引人注目的进展，为新生儿IMD筛查开辟了新的领域，但由于新生儿血液中代谢物水平、酶活性等易受新生儿生理状态、母体因素、采血时间等多种因素影响，如先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia，CAH）、甲基丙二酸血症等疾病筛查结果假阳性率较高，阳性预测值低，大大增加了召回和随访难度；同时某些筛查指标特异度不强，存在漏筛风险，假阴性率高，如希特林蛋白缺乏所致新生儿肝内胆汁淤积症（neonatal intrahepatic cholestasis caused by Citrin deficiency，NICCD）、戊二酸血症Ⅰ型等。另外，部分遗传代谢病的临床表型具有高度异质性，需结合多种分析手段进行诊断，如MS/MS与血液酶学检测或与尿液气相色谱检测相结合，对于高度疑似的疾病，最后仍需基因检测确诊，导致疾病周期长，延误治疗。此外，有些疾病没有特异的代谢物可供方便检测，使得直接对疾病的致病基因进行检测是唯一的选择。随着基因测序技术的快速发展、医学遗传学研究的不断深入，以及治疗遗传病的新药不断涌现，越来越多的由基因变异引起的遗传病基因筛查和相关临床研究在国内外广泛开展，突显了基于基因检测的新生儿疾病筛查与诊断在出生缺陷三级防控中早诊断、早治疗的广阔前景。

一、新生儿基因筛查的基本原则

（一）疾病选择原则

1968年，Wilson和Jungner回顾分析了新生儿筛查的历史，提出了新生儿疾病筛查应符合的10项原则：①对筛查的疾病已有全面了解；②筛查的疾病可治疗；③具有有效的诊断和治疗设施；④可识别的早期症状；⑤具有迅速准确可靠的检测方法；⑥适合群体大样本检测；⑦能及时报告和确诊；⑧严格质量控制；⑨有干预和随访系统；⑩成本在经济上平衡，强调不仅要通过可靠、经济的方法筛选出严重的先天性疾病，更需要后期有效的治疗及连续的随访干预。

2010年7月美国新生儿和儿童遗传性疾病咨询委员会（American Advisory Committee on Neonatal and Genetic Diseases）更新了候选病种的评估方法，目前国际上公认的新生儿疾病筛查病种的选择标准为：①疾病危害严重，可导致残疾或死亡；②发病率相对较高，且发病机制与异常产物已阐明；③疾病早期无特殊症状，但有实验室指标能显示阳性；④有准确可靠、适合在新生儿群体中大规模进行筛查的方法，假阳性率和假阴性率均较低，并易为家长所接受；⑤已建立有效治疗方法，特别是通过早期治疗能逆转或减慢疾病发展，或改善其预后；⑥筛查费用、医学治疗效果及社会经济效益的比例合理。

新生儿疾病基因筛查在遵守上述原则的基础上，同时还需要遵守以下原则：①测序或其他遗传学方法不应取代原有的新生儿疾病筛查方法；②医疗团队需有较好的遗传学基础与大数据分析能力；③严格保护婴儿及其家人隐私。

（二）知情同意原则

新生儿基因检测就是对新生儿的基因进行筛查，对新生儿的一些先天性疾病患病风险和儿童药物敏感基因进行评估和提示。新生儿基因筛查的首要流程就是对其父母进行相关知识的宣教和知情同意选择。新生儿基因筛查应遵循自主性（知情选择）、有益性（良好效益）、安全性（避免伤害）和公平性（公正平等）的规则。同时，基因筛查项目制订需要充分考虑疾病的发病率、筛查技术的可行性、推广性及可治性等关键问题。在我国新生儿疾病筛查遵循知情选择原则，具有法律约束，但并非强制性。目前主要通过新生儿疾病筛查宣传手册、演讲等方式让家属了解新生儿基因筛查的方法和意义，签订书面知情同意并签字执行。

（三）个人信息保密原则

新生儿由于没有完善的自我认知，无自主选择能力，通常其知情同意选择和决定权只能由其父母或其他家属代为行使，甚至有些弃婴选择做新生儿筛查的权利也只能完全由医生决定。新生儿基因筛查更是涉及多机构多环节的系统工程，新生儿和其监护人信息随着血样卡片要经过标本采集医院、快递公司或邮局，以及筛查中心三个环节多个医护人员，医务人员要严格遵守医务工作者道德操守，减少无关人员参与，降低信息外漏概率，为其保守个人信息应是每个医护人员遵守的职业操守和义务。

（四）保证标本质量原则

新生儿的基因筛查目前已经覆盖除乡镇卫生院级别以外的各级别医院，不同医院的医护人员、工作环境分配不同，导致样本采集量、储存方式、保存时间、递送路途、检测指标等各方面都难免存在差异。标本采集的质量是新生儿筛查最重要的环节，应该注重采血过程、血样保存时间及转运过程，避免对测定结果产生不良影响，检测机构应安排固定专人负责新生儿筛查标本的采集与送检。纸血片标本晾干后要用筛查中心提供的封口袋密封装在专用递送信封内，减少信息泄漏机会，才能提高新生儿筛查的质量，尽量减少假阳性和假阴性的发生。

（五）治疗和随访尊重家属意愿原则

对于筛查阳性和确诊的患儿，通常其家属都会出现精神焦虑、痛苦、绝望等负面情绪，因此需要相关人员做好安抚、沟通和解释工作，从而缓解家属的精神压力；同时也要在尊重监护人和家属意愿的原则上积极开展治疗和进行随访。新生儿基因筛查费用有相对便宜和昂贵之分，建议诊疗费用可否纳入医保以缓解患儿家庭经济压力。国内和国外研究均显示新生儿筛查具有良好的成本效益比，这些都证明了新生儿基因筛查的可行性。新生儿筛查的出现，改善了患儿今后的生活质量，减轻了社会压力，也符合医学伦理学有利原则。

（六）资源配置公平公正原则

新生儿基因检测筛查还应具备公平原则，让每位新生儿都享有相等的权利和资源保障。目前，我国新生儿基因检测和诊断服务覆盖率低、服务能力不足、效能不高，以及遗传病诊断区域发展不平衡。此外，当前新生儿基因检测价格较为昂贵，有些区域尚未纳入医保，这些都导致了新生儿基因检测的供需不平衡。国际人类基因组伦理委员会在《药物基因组学社会共济、公平和管理问题声明》中也提到，公平的目的在于降低不同人群健康的不平等，努力实现医疗卫生资源公平分配。资源配置的公正表现包括机会公正和实质公正，机会公正即每个新生儿机会均等地获取基因检测资源；实质公正则强调按需分配，即根据需要原则，优先保障新生儿享受基因检测资源。随着基因组学的发展，运用基因检测技术进行相应疾病的筛查诊断成为当前医疗卫生服务的新项目。因此，如何保证公正原则，合理公正地分配医疗资源，实现新生儿基因检测的公益性，让每位新生儿机会均等，尽可能让每个新生儿获得公平的检测机会对保障新生儿的健康权利，满足其基本的医疗需求有重要意义。因此，新生儿基因筛查应在公正原则的伦理要求下，平等公正地配置新生儿基因检测医疗资源，满足广大民众的基本医疗需求，保护新生儿的健康利益。

二、新生儿基因筛查技术进展

按照Wilson-Jungner标准，用于新生儿筛查的技术必须简便可靠。根据不同疾病的特征指标或临床表型，很多技术被应用于新生儿疾病筛查。经过60年来的发展，新生儿疾病筛查技术不断发展和更新，从基于生化、酶学的传统筛查技术到目前发展迅速的基因检测技术，使新生儿疾病基因筛查项目已展现出良好前景，但新生儿疾病基因筛查仍处在探索之中。

（一）新生儿疾病传统筛查技术

1.细菌抑制法

是对干血滤纸片中的苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）进行半定量测定，早期主要应用于苯丙酮尿症的筛查，具有结果直观、操作简单，不需要特殊仪器设备等优点，但该检测方法在实验中引起误差的影响因素较多，结果判读受主观因素的影响较大，且只能进行半定量检测，精确度不够，不能为临床提供一个明确治疗依据。

2.酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，具有快速简便、易于标准化等优点，在早期先天性甲状腺功能减退症筛查中得到广泛应用，但该法灵敏度较低，容易漏检，且酶液容易受温度影响，有效期较短，强光照射也会影响试剂灵敏度。

3.时间分辨荧光免疫法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）

是一种非放射性核素免疫分析法，通过测定干血滤纸片中促甲状腺素和 17α-羟孕酮（17α-HOP）含量分别对新生儿先天性甲状腺功能减退症与先天性肾上腺皮质增生症进行筛查，因检验结果更为可靠而逐步取代了ELISA。该法主要具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好等优点，极大地提升了光学分析的灵敏度。

4.荧光法

化学荧光定量法是国内推荐的PKU筛查方法，通过检测反应产物的荧光强度测定计算受检样本中Phe浓度。相对于细菌抑制法，该检测方法灵敏度高、抗干扰能力较强，能准确测序Phe含量，对临床的治疗诊断有较大的意义，且还可用于诊断有遗传基因缺陷的无症状的家属和患者，但操作较为烦琐。荧光斑点法是目前各国常用的直接测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的筛查方法，国内许多实验室采用荧光斑点试验作为初筛，然后采用G6PD/6PGD比值法做定量诊断。该方法操作简便、快捷、重复性好、费用低廉，适用于大批量样本筛查，但结果易受主观判断影响、对轻度患者检出率不高、对样本新鲜度要求高、结果易受样本保存方法的影响等问题。

5.串联质谱法

高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统，可一次检测氨基酸和肉碱等40多种指标，同时筛查出氨基酸代谢异常、脂肪酸代谢异常及有机酸血症等50余种IMD，大大提升了筛查效率，实现了从“一种实验检测一种疾病”到“一种实验检测多种疾病”，特异度高、灵敏度强、检测快速、通量高的特点。但是有些疾病不能用MS/MS筛查，包括先天性甲状腺功能减退症、听力损伤、囊性纤维化和生物素酶缺乏症等。另外，代谢物指标受多种因素影响，且部分指标变化对疾病判断的特异性不高而容易造成漏诊。

虽然传统新生儿筛查通过检测代谢物浓度或酶活性简便易行且成本较低，但方法学具有局限性，筛查病种有限，因新生儿血液中代谢物水平、酶活性等易受新生儿生理状态、母体因素、采血时间等多种因素影响，先天性肾上腺皮质增生症等疾病筛查结果假阳性率较高；而某些筛查指标特异度不高，NICCD和戊二酸血症Ⅰ型等假阴性率高。另外，部分IMD的临床表型具有高度异质性，需结合多种分析手段进行分析诊断，如MS/MS与血液酶学检测或尿液气相色谱检测相结合，对于高度疑似的疾病，最后仍需基因检测确诊，导致疾病周期长，延误治疗。此外，有些疾病没有特异性代谢物可供检测，使得直接对疾病的致病基因进行检测是唯一的选择。

（二）基于基因检测的新生儿疾病筛查技术

基因检测技术可以弥补生化、酶学、MS/MS等筛查方法的不足。根据不同基因致病变异的特点，可以采取不同的基因检测方法进行新生儿疾病筛查。

1.实时荧光定量PCR（QF-PCR）

通过荧光探针（Taqman探针）或荧光染料（SYBR）标记实现对PCR产物量增加过程中的实时监控，在PCR到达指数期时进行定性或半定量检测。荧光定量PCR技术主要应用于新生儿耳聋基因、脊髓性肌萎缩、地中海贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、重症联合免疫缺陷病、X连锁无丙种球蛋白血症等疾病筛查。该技术具有特异度强、灵敏度高、操作简便等特点，但只能针对已知突变位点进行设计和检测。

2.基因芯片

该技术基本原理是核酸杂交，根据DNA互补配对原则，利用基因探针识别特定基因，通过检测杂交信号的强度及分布，对待检序列进行定性或定量检测。常用的基因芯片是亲和表面芯片，其原理是将大量检测探针以预先设计的方式固定在玻片、硅片及纤维膜等载体上组成密集的探针阵列，将样本通过PCR扩增并进行荧光标记，然后与芯片探针杂交，再用激光扫描杂交信号，通过芯片判别系统进行信号读取及判断，得到基因表达或突变的信息。多用于新生儿耳聋基因筛查、囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）、杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）二阶筛查等，利用聚合芯片电泳的方法还能早期筛查诊断脆性X染色体综合征。此外，基因芯片技术也被应用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症和苯丙酮尿症的基因检测。该技术具有高通量、自动化、微型化等优点，检出率及准确性高，适合于临床大样本的筛查。

3.MassARRAY核酸质谱技术

该系统基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，整合了PCR技术的高灵敏度、芯片技术的高通量和质谱技术的高精确度，是目前唯一应用质谱技术直接检测单核苷酸变异的技术平台。其原理是进行待测基因靶向PCR扩增后的产物，加入目标变异序列特异延伸引物，在变异位点上，延伸1个碱基。然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管用强激光激发，核酸分子转变为亚稳态离子按照其质荷比率分离，在真空小管中飞行到达检测器。主要特点为高准确度和灵基因分型分析。

4.二代测序

也称为下一代测序（next generation sequencing，NGS），能同时对几十万甚至几百万DNA分子进行平行测序。与一代测序（Sanger法）相比，NGS可以以很低的成本对大量的DNA序列测序，可以同时覆盖多个基因的所有编码序列。根据检测覆盖范围的不同分为三大类：靶向测序（targeted sequencing，TS）、全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）及全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）。TS 针对一组特定疾病基因组成检测包（Panel），对特定疾病相关的致病基因进行靶向捕获或富集，然后进行NGS测序。该技术检测周期短，可一次性检测多个基因，小范围的检测具有更高测序深度、灵敏度强。WES是对整个基因组中所有编码序列进行测序，可以检出整个外显子区域的突变，相比于Panel测序范围更大，还能发现新的致病突变，尤其适用于对目标疾病诊断没有明确方向时进行检测。WGS覆盖整个基因组，较WES覆盖区域更广，在检测非编码区变异、拷贝数变异、线粒体基因组变异等方面更具优势，相比于WES在疑难病例诊断方面效率更高，但是成本高和数据分析的挑战，使该技术在临床应用上具有局限性。

三、新生儿基因筛查进展

20世纪初期，遗传学家摩尔根通过果蝇的遗传实验，认识到基因存在于染色体上，并且在染色体上呈线性排列，从而得出了染色体是基因载体的结论。1909年丹麦遗传学家约翰逊（W.Johansen）在《精密遗传学原理》一书中正式提出“基因”概念。20世纪50年代沃森和克里克提出了DNA双螺旋结构以后，人们进一步认识了基因的本质，即基因是具有遗传效应的DNA片段。研究结果还表明，每条染色体只含有1～2个DNA分子，每个DNA分子上有多个基因，每个基因含有成百上千个脱氧核苷酸。基因（遗传因子）是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。基因支持着生命的基本构造和性能，储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡等过程的全部信息。生命繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程，生物体的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关。它也是决定生命健康的内在因素。进入21世纪后，很多科学家和临床医师应用PCR和NGS等分子生物学技术，探索对新生儿疾病进行基因检测和基因筛查。目前，基因检测技术在国内外新生儿疾病相关研究进展主要集中在以下三方面：①对于生化指标异常者再次使用干血滤纸片进行基因筛查，包括CF、DMD和NICCD等疾病；②对特定发病机制明确的疾病直接进行靶向基因或DNA筛查，包括遗传性耳聋、重症联合免疫缺陷病（severe combined immunodeficiency disease，SCID）、脊髓性肌萎缩（spinal muscular atrophy，SMA）、脆性X染色体综合征（fragile X syndrome，FXS）等疾病；③基于NGS技术在新生儿疾病基因筛查的探索性研究，通过WES或WGS技术在新生儿遗传病风险预测、携带者筛查和疾病诊断方面研究。

（一）基因检测作为新生儿疾病的二阶筛查

CF是白种人中最常见的常染色体隐性遗传病。1979年，Crossley团队发现CF患儿干血斑中免疫反应性胰蛋白酶（immunoreactive trypsin，IRT）浓度显著升高。继而，澳大利亚和美国等国家开始采用IRT/IRT方法对新生儿进行CF筛查，即对IRT指标初筛异常患儿召回再次采血检测IRT，但临床发现一些患儿二次召回采集的血样中IRT水平急剧下降。因此，20世纪90年代初美国威斯康辛州与澳大利亚一起开发了IRT/DNA筛查方法，即对IRT指标初筛异常患儿，使用已有干血斑检测CFTR基因突变进行二次筛查。IRT/DNA二阶筛查路径的应用，可以避免二次筛查IRT水平降低的问题，使CF筛查的灵敏度明显提升。直到2010年，美国50个州都已开展CF新生儿二阶基因筛查。

DMD可以通过测定干血斑中肌酸激酶（creatine kinase，CK）浓度进行新生儿筛查，但该方法具有较高的假阳性。2012年，Mendell等首次建立了CK浓度检测联合DMD基因检测的二级筛查方法，首先测定干血斑中CK浓度，再对CK浓度较高样本，利用同一血斑采用多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）分析 DMD 基因的变异情况。在37 649例男性新生儿受试者中，发现6例有DMD基因外显子缺失变异，其CK水平均＞ 2 000U/L。另有 3例 CK 水平＞ 2 000U/L 的样本中未发现DMD基因异常，但发现了肢带肌营养不良相关基因变异。研究表明，通过二次基因筛查既能有效降低CK筛查假阳性，还能为筛查阳性新生儿的初次随访提供路径。随后，澳大利亚和中国浙江大学医学院附属儿童医院开展了该方法的试点研究。在该院开展的DMD新生儿筛查试点研究，采用检测CK对96 409例男性新生儿干血斑样本进行了筛查，共发现400U/L＜ CK ＜ 700U/L 的新生儿 396 例，CK ＞ 700U/L 新生儿83例，再次通过基因检测，最终确诊17例DMD和2例BMD，男性新生儿发病率为1：4 560。

NICCD是一种因SLC25A13基因表达异常导致的希特林蛋白（Citrin）功能缺陷，进而造成一系列生化代谢紊乱的隐性遗传病。现主要通过MS/MS测定干血斑中瓜氨酸浓度进行该疾病的早期筛查。由于新生儿出生后瓜氨酸浓度可能不会立即升高，导致该疾病MS/MS漏筛较多。浙江大学医学院附属儿童医院一项研究，将3万余例瓜氨酸为18～38μmol/L（瓜氨酸指标的cut-off值为38μmol/L）的新生儿，采用MassARRAY技术平台进行SLC25A13基因热点突变位点检测，确诊了5例MS/MS漏筛的NICCD患儿，表明MS/MS联合基因筛查能提高NICCD的检出率。

目前，基于NGS的超高重PCR、MassARRAY核酸质谱技术和靶向测序Panel等常用于新生儿疾病的二阶基因筛查与诊断，对于初筛阳性的样本，在不召回新生儿前提下二次使用剩余的干血斑，能有效降低初筛假阳性率，同时能避免因二次采样引发漏诊的可能。

（二）特定新生儿疾病的靶向基因筛查

前面把靶向基因作为NGS中的一类，但下面多个疾病用的是一代测序（如SCID、X连锁无丙种球蛋白血症、脊髓性肌萎缩和脆性X染色体综合征）。

SCID是原发性免疫缺陷（primary imm unodeficiency disease，PID）中最严重的疾病类型，T淋巴细胞在胸腺正常发育过程中，抗原受体编码基因需进行DNA剪切并重组，切下来的DNA形成一种副产物，T细胞受体剪切环（TRECs），表达αβT细胞受体的T细胞中，70%在成熟晚期都产生Rec-Jα TREC，采用巢式-实时定量检测新生儿干血斑中游离TRECs数量，可以反映外周血最新产生的T淋巴细胞数量，目前已广泛应用于新生儿SCID筛查，TREC拷贝数减少或缺失，提示怀疑SCID。2008年，美国Wisconsin首次开展了SCID和其他T淋巴细胞减少症的新生儿筛查试点项目，共筛查了207 696例新生儿，其中72例结果异常，经T淋巴细胞计数后发现33例异常样本，阳性预测值为45.83%，特异度为99.98%，假阳性率为0.018%。最终确诊了5例SCID/严重T淋巴细胞减少症患儿，证实了该筛查方法的灵敏度和特异度均高。2010年，在一系列循证审查的基础上SCID被纳入全北美新生儿的推荐通用筛选计划（Recommended Uniform Screening Panel，RUSP）。目前，SCID新生儿筛查已在美国各州广泛开展。2010年，台湾大学累计对106 391名新生儿进行了SCID筛查，发现5例结果显示异常，其中2例确诊为SCID，新生儿SCID发病率约为1：53 196。现英国、法国、西班牙和巴西等国也陆续开展SCID新生儿筛查的试点研究，我国内地尚未广泛开展相关工作。

X连锁无丙种球蛋白血症（X-linked agammaglobulinemia，XLA）是一种原发性免疫缺陷，由BTK基因突变导致成熟的外周B淋巴细胞数量严重减少而引起。B淋巴细胞在正常发育过程中，抗原受体编码基因需进行DNA剪切并重组，切下来的DNA形成一种副产物，即免疫球蛋白K删除重组切除环（intronRSS-Kde recombination excision circles，KRECs），利用定量 PCR 检测 KRECs可以反映最新产生的B淋巴细胞数量。2011年，Nakagawa团队开展了检测新生儿干血斑中KRECs对XLA和非XLA进行筛查的方法学研究，通过RT-PCR对30例XLA患者、5例非XLA患者，以及133例新生儿和138例不同年龄段的健康人群的干血斑中KRECs检测，发现XLA和非XLA患者样本中均检测不到KRECs，证实测定干血斑中的KRECs可用于XLA和非XLA的大规模新生儿筛查。随后，瑞典、西班牙、塞维利亚和伊朗等国相继开展了XLA和SCID（KREC/TREC）联合筛查试点研究。

脊髓性肌萎缩（spinal muscular atrophy，SMA）是一种常染色体隐性神经肌肉疾病，发病率约为1：（5 000～10 000）。约 95% 的 SMA 患者因 SMN1基因纯合缺失引起。2016年12月基因治疗药物诺西那生钠（Nusinersen）注射液获FDA批准，2017年获欧盟批准上市；2019年2月该药品在中国获批。应基因治疗药物的问世，2017年美国纽约开展了SMA新生儿筛查试点，该项目采用RT-PCR技术检测新生儿干血斑中SMN1基因7号外显子的拷贝数。共招募3 826例新生儿受试者，结果显示SMA突变总体携带率为1.5%，检出1例SMN1基因7号外显子纯合缺失患儿，该患儿随后被纳入NURTURE临床试验项目，并在15日龄时接受了诺西那生钠治疗，1周岁时未发现任何呼吸问题。此项研究初步证明了SMA新生儿筛查的可行性，并建议将SMA纳入新生儿筛查病种。2018年，SMA被美国RUSP纳入首要筛查病种。目前美国已有6个州开展SMA新生儿筛查。同年，我国台湾省也发表了SMA筛查研究结果，采用RT-PCR技术对120 267例新生儿进行初筛，发现15例阳性，再采用数字PCR（ddPCR）进行复查，最终确诊7例SMA患儿，证实通过早期筛查可以在症状产生前发现SMA患者，有利于早期进行治疗干预。2019年，Kariyawasam等报道了澳大利亚SMA新生儿筛查项目的实施情况，共计筛查103 903例新生儿，10例阳性，最终确诊9例患儿，4/9（44%）新生儿在出生后4周内出现SMA相关临床症状，新生儿SMA筛查在支持父母早期决策，促进个性化治疗方案实施等方面，展现出重要的临床应用价值。

脆性X染色体综合征（fragile X syndrome，FXS）是最常见的单基因引起的遗传性智力低下综合征，其发病机制是由于X染色体上FMR1基因5'端非翻译区三核苷酸重复序列（CGG）n动态突变引起。FXS筛查可以应用PCR技术扩增FMR1基因的启动子区域，检测（CGG）n的重复数来鉴别患者及携带者。自1995年起，加拿大、美国和西班牙等多个国家和地区开展了FXS新生儿筛查的方法学及筛查研究。2012年，美国发表了对14 207例新生儿（7 312例男性和6 895例女性）的筛查报告，结果显示灰区［54 ＞（CGG）n＞ 45］携带率，男性为 1/112，女性 1/66；前突变［200 ＞（CGG）n ＞ 54］携带率男性为1/430，女性1/209；发现 1例男性全突变［（CGG）n ＞ 200］，证实FXS新生儿筛查技术上的可行性，同时表明美国地区前突变携带率较高。虽然对FXS进行筛查在技术上是可行的，但因FXS无有效的治疗方法，是否对FXS展开新生儿筛查还存在争议。此外，FMR1基因前突变对新生儿影响具有不确定性，且前突变携带者较为普遍，对筛查出前突变的家庭进行遗传咨询带来较大负担。

先天性耳聋通过传统的新生儿听力筛查，无法发现迟发性和药物性耳聋，而其中部分是由于遗传因素导致的。2006年，Morton等首次提出对少数遗传性耳聋相关基因（GJB2、SLC26A4和MT-RNR1基因）进行筛查有利于提高对迟发性语前耳聋的检出。2007年，我国一项多中心（11个省12家医院）新生儿遗传性耳聋基因筛查研究，共14 913例新生儿在接受常规听力筛查，同时针对mtDNA12S rRNA、GJB2和SLC26A4基因进行了基因筛查。结果显示306例新生儿携带1个或2个基因突变，总体携带率为2.05%。其中7例携带GJB2或SLC26A4基因的纯合或复合杂合变异；18例携带12S rRNA基因致病突变。随后，我国台湾、成都、北京、天津和广东等省市也开始遗传性耳聋基因筛查项目。截至2018年底，全国接受遗传性耳聋基因筛查的新生儿数量超过320万，检出总突变率为4.4%，其中药物致聋基因携带者约8 400人，避免了受检者和家庭成员约80 000多人因使用药物不当而致病。

（三）基于NGS技术的WES/WGS新生儿基因筛查的探索

2013年美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）和美国国立人类基因组研究所（National Human Genome Research Institute，NHGRI）投入2 500万美元共同资助了4个研究团队，探索基因组测序在新生儿疾病筛查中的应用及影响，包括：①对个体和公众健康的影响；②对医生和家长态度的影响；③对公共卫生系统支出的影响。其中3个项目采用WES技术（BabySeq/NBSeq/NC NEXUS），1个为 WGS 技术（STATseq）。

BabySeq项目入选标准：①出生在波士顿妇女医院（BWH）且入住健康婴儿室（WNN）的新生儿或转入波士顿儿童医院和妇女医院（BCH/BWH）新生儿重症加护病房（neonatal intensive care unit，NICU）的新生儿；②至少有一个生物学父母进行遗传咨询、提供DNA、签署新生儿检测同意书。排除标准：①父母不会讲英语；②父母不愿意将基因报告写入医疗记录或发送给他们的初级保健医生；③母亲或父亲年龄＜ 18岁；④母亲或父亲不具备决策能力；⑤新生儿日龄超过42天；⑥多胎妊娠；⑦临床考虑不适合抽取1ml血液的任何新生儿；⑧在受试招募前已做过临床外显子检测；⑨缺少生物学父母（如知道）或养父母（如果合适）的知情同意。开始接洽了3 860个家庭，其中3 424个来自健康新生儿家庭（WBN），436个来自NICU患儿家庭，总入组率为6.9%［WBN队列为6.5%（n=223），NICU患儿队列为10.3%（n=45）］；拒绝入组的原因中，对此研究不感兴趣家庭竟占了58%。该项目纳入了127例健康新生儿和32例NICU患儿，对1 514个基因进行了测序，NGS显示15/159（9.4%）新生儿有儿童期发病的风险（包括10例健康新生儿和5例NICU患儿），健康新生儿测序组中还发现一个成人期发病的BRAC2基因突变。NICU患儿测序组中发现2个成人期发病基因突变，分别为BRAC2和导致Lynch综合征的MSH2基因。140例（88%）新生儿至少携带一个儿童期发病的隐性致病突变，8/159（5%）新生儿检测到药物基因组学突变，表明NGS能有效预测患病风险和携带者，且目前已有的新生儿筛查则无法进行预测。所有入组的新生儿均会收到新生儿基因测序报告（neonatal gene sequencing report，NGSR），该报告包含与儿童期疾病和可能与儿科药物基因组学相关的风险和携带者情况。此外，患病的新生儿会进行基于适应证的分析，该分析包含所有导致新生儿疾病的基因变异，并可以选择是否查询与婴儿护理相关的药物基因组学变异。制定报告标准的目的是最大程度地提高收益和减少低外显率、迟发性，以及证据不足等带来的不确定性。

NGSR基因报告标准：①儿童期疾病风险（＜ 18岁发病），有充分的证据表明该基因会导致高外显率的儿童期疾病；②在儿童时期进行干预可能避免后续重大疾病发生相关的具有中等证据或中等外显率的基因，此类致病变异报告带来的收益可能会超过其带来的不确定性；③与儿科药物基因组强关联的基因（Pharm GKB数据库中class 1和2A基因），包括与恶性高热相关的RYR1、硫嘌呤毒性相关的TPMT，以及与溶血性贫血相关的G6PD；④符合以上标准的基因携带者情况；⑤只报告致病和疑似致病的变异。

NGSR包含的三类基因：A类，对儿童期发病的疾病具有很高的预测价值的基因，包含884（58%）基因-疾病对；B类，具有中度证据和/或外显率的基因，儿童期无创干预可防止破坏性结果；或成人期发病，但儿童期的无创干预可能显著改善临床结果，包含70（4.6%）基因-疾病对；C类，缺乏导致疾病的证据，具有低/中度外显率或与成人发病条件有关，没有证据表明儿童期非侵入性治疗起作用，但与患者的症状相关。BabySeq项目研究存在局限性，是一小队列研究、样本少，另外先证者外显子可能遗漏新发突变。

NBSeq项目则通过对1 570例新生儿干血滤纸片样本基因测序与MS/MS结果比较，评估外显子测序在新生儿干血滤纸片筛查中的应用潜力，探索其是否可以提升或替代目前的MS/MS筛查技术的可行性。结果显示基因检测作为二阶筛查或补充筛查方法，可降低MS/MS筛查假阳性率，从而提高筛查的特异度，同时辅助非特异性生化指标可鉴别诊断。

NC NEXUS项目探索能否扩大WES在新生儿筛查中的应用，设计和评估基于NGS的新生儿筛查分析框架，明确相关伦理、法律和社会影响等，当患儿家庭需要做出决定时，对他们想要了解的WES相关信息进行分类，开发辅助决策系统帮助临床医生和家长在复杂检测结果中做出合理决定。

STATseq项目对NICU住院患儿随机分组，一组为新生儿筛查的标准化检测途径，一组为快速WGS+标准化检测，比较两组在疾病诊断率、诊断时间、评估发病率和死亡率、医生和家属的受益情况等。共42例患儿进行快速WGS检测，诊断率明显高于对照组（43% vs. 10%）；临床受益率也高于对照组（31% vs. 2%）。对于NICU住院患儿，快速WGS可作为一阶检测，但该技术在临床的适用性需要进一步明确。

英国也已开始将WGS应用于新生儿疾病筛查的试点研究。2019年7月，Genetic Alliance UK发布了一份报告，推荐尽快试行新生儿的WGS筛查新生儿疾病，并就试行项目可能遇到的问题和挑战进行了分析和讨论。同年11月5日，英国卫生部部长宣布英国国家卫生部计划从20 000例儿童的基因测序试点研究开始，将对每个在英国出生的新生儿进行基因测序，以检测新生儿的遗传病风险并提供可预测的个体化的护理。

复旦大学附属儿科医院周文浩团队、浙江大学附属儿童医院赵正言团队等，在早期使用医学外显子检测方案，聚焦NICU住院患儿的疑似遗传病快速诊断、建立新生儿遗传病基因检测标准、新生儿IMD的二阶筛查、遗传咨询培训、应用Panel、WES甚至WGS在新生儿疾病基因筛查等方面，进行了大量的探索。

四、新生儿基因筛查的挑战

通过基因测序来进行新生儿疾病筛查，也面临着很多挑战。随着越来越多遗传病治疗方法和新药的出现，符合新生儿筛查原则的病种越来越多，在这些疾病中，基于酶学、代谢物等筛查技术已无法满足更多的筛查需求，很多疾病都无法用传统的筛查技术来鉴别，故基因测序技术特别是NGS技术的筛查方法，将成为一种重要的补充。全球基因组学与健康联盟（Global Alliance for Genomics and Health，GA4GH）是由400多家医疗保健、研究、疾病宣传、生命科学和信息技术机构组成的国际合作机构，期望通过共享基因组和临床数据共同促进人类健康，他们就基因组技术用于基于人群的新生儿筛查提出了八项建议，并在此职权范围内，成立了全球联盟监管和道德工作组的儿科工作组，以解决与儿童健康特别相关的问题。现归纳为以下七点。

1.每个婴儿都有平等获得筛查的机会。通过任何方法进行的新生儿筛查，包括基因组检测，如果作为公共卫生计划采用，在该管辖区内出生的每个婴儿都应该平等获得检测的机会。

2.设立公共数据库，新生儿基因筛查结果的解释基于对每个测试基因的良性变异及致病变异的了解。需要在一个可自由访问的数据库（同时适当保护个体婴儿及其家人隐私）中公布该计划中包含的每个基因的特定人群等位基因频率、每个等位基因的致病性评价，以及支持致病性解释的证据。

3.仅限新生儿期诊断并在儿童期有效治疗或干预的疾病。

4.依据新生儿筛查完整体系管理，包括确诊检测、治疗干预、临床随访、遗传咨询、质量保证、公共和专业教育及行政监管体系。

5.通过新一代测序或其他基因组方法进行的新生儿筛查，应仅被视为当前一级筛查计划的补充。

6.不应替代现行所筛病种的筛查方法。目前新生儿筛查的任何疾病不应该用NGS或其他基因组方法取代，除非基因组技术已被证明对疾病具有相同或更好的灵敏度和特异度。遗传异质性和复杂性使基因检测不可能像当前筛选方法一样灵敏或特异，即使是遗传异质性和复杂性较少的疾病，基因组检测也不是基于人群的新生儿筛查的最有效方法。

7.谨慎进行政策和伦理评价（基因组和Panel）。需进行研究以证明基因组、Panel测序的临床效用和成本效益，并在新生儿基因筛查实施之前解决突出的健康政策和伦理问题。新生儿基因组筛查必须避免损害当前筛查计划的有效性和无意伤害儿童及其家人，各个国家和地区在伦理层面须达成政策共识，如基因组临床意义不明（variant of undetermined significance，VUS）和家庭意外发现的披露，数据的所有权，以及数据的存储和共享等。医疗机构应对新生儿家长进行检测前知情告知。

关键问题是如何改进对基因组数据的解释，以便能够有效识别筛查的每个致病基因和良性变异，如何处理与成人发病相关的携带者状态变异，NGS存在无法检出结构变异和三核苷酸重复，以及检出临床意义不明等情况，对于临床意义未明突变，结果解释的不确定性对实验室和临床医生均存在一定的法律风险，检测前和检测后对医生的遗传咨询能力和报告解读能力有很高的要求。在筛查阳性患儿中，由于遗传咨询的关联性，使具有血缘关系的相关人的隐私也牵连其中，需对亲属信息严格保密，避免隐私权相关的伦理问题；基因组范围测序产生大量个人信息，需避免数据存储及隐私性相关问题的泄露。另外，在基因筛查过程中对携带者的发现如何报告还存在争议。在实验技术层面，需提前明确基因测序应用在疾病筛查中的局限性，做好风险预估，制订相应的解决措施。

总之，新生儿疾病基因筛查的探索还在路上，且面临着很多挑战，但已为儿童疾病的预防、诊断、治疗、康复展现了良好前景。

（赵正言）